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| 价格： | ￥6800.00 |
| 品牌： | NEWLF  |
| 货号： | NL27015 |
| 规格： | 30 Assays |
| 用途
体内 Rab4A 激活水平的分析。
检测增强 Rab4A 活性的化合物和蛋白质。
检测抑制 Rab4A 活性的化合物和蛋白质。
对细胞（组织）中的 Rab4A 活性进行定位、定性、定量研究。
| 产品说明
Rab4是一种进化上保守的GTP结合蛋白，主要定位于网格包被囊泡、早期内体和循环内体，是细胞内吞、循环过程的重要调节因子. Rab4包括Rab4A、Rab4B和Rab4C 3个不同的亚型. Rab4在结合GDP或水解GTP之间不断转换变化，介导胞膜表面蛋白的快速内吞、分选与循环运输，影响囊泡定向运动所需的分子间相互作用.目前尚无直接测定Rab4-GTP活性的方法。
77779193永利的 Rab4A 活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的 Rab4-GTP 单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行 GTPγS 活化处理）活性 Rab4-GTP 的水平。简言之特异性识别 Rab4A 活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的 Rab4A-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G 将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用特异性识别 Rab4A 的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。每个试剂盒可以进行30次免疫亲和沉淀检测 ，同时试剂盒中的 Rab4A- GTP 单克隆抗体也可以通过免疫组化和免疫荧光实验对细胞和组织中Rab4A的活性进行监测。
| 检测原理
77779193永利的 Rab4A 活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的 Rab4A-GTP 单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行 GTPγS 活化处理）活性Rab4A-GTP的水平。简言之，特异性识别 Rab4A 活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的 Rab4A-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用特异性识别 Rab4A 的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。
| 试剂盒组份及储存
|
名称 |
货号 |
规格 |
储存温度 |
|
Anti-active Rab4A mouse Monoclonal antibody |
Cat.#NL23015 |
1x35ul |
-20℃ |
|
Protein A/G Agarose |
Cat.#NL30301 |
1x600ul |
4℃ |
|
5xAssay/ lysis Buffer |
Cat.#NL30303 |
1x30ml |
4℃ |
|
Anti-Rab4A Rabbit polyclonal antiboy |
Cat.#NL24015 |
1x50ul |
-20℃ |
|
100xGTP-rS |
Cat.#NL30302 |
1x50ul |
-80℃ |
|
100XGDP |
Cat.#NL30304 |
1x50ul |
-80℃ |
|
HRP-Goat anti-Rabbit IgG |
Cat.#NL29002 |
1x50ul |
-20℃ |
注意:使用前应将100xGTP-rs和100xGDP 分装成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 冻存，避免反复冻融。
试剂盒所需自备物品。
1.刺激和未刺激的细胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制剂；
3. 4 °C 摇杆或者摇床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 电泳和免疫印迹相关试剂；
8. 免疫印迹缓冲液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；
9. 免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；
10 ECL 检测试剂；
试剂盒注意事项
1.收到试剂盒后如不立即使用，请将试剂盒组分按照标签说明存储在相应的温度，100xGTP-rs和100xGDP 分装成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 冻存，避免反复冻融。
2.Protein A/G Agarose使用前请稍微离心甩一下，因管壁上可能残留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇挥发，体积较少时很难将Agarose吹散，所以请补充20%乙醇等于Agarose的体积。
3.使用50% 的Protein A/G Agarose前先用枪将其吹匀，一个反应管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足够。
4. 将50% 的Protein A/G Agarose加入反应管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗涤3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合适体积的1×Assay/Lysis Buffer悬浮Agarose，再分装于 反应管，保证每管参与反应的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。
5. 为了减少50% 的Protein A/G Agarose的损失，可以先在反应管中加入适当体积的1×Assay/Lysis Buffer。
6. 反应管中试剂加入顺序建议，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀释的Protein A/G Agarose，细胞裂解液和活性抗体，总体积建议0.5ml-1ml
7. 活性抗体的加入量请适当做调整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。
8. 孵育反应在4℃ 360度摇床进行。
9. 反应完毕，洗涤Agarose时候，尽量避免吸走Agarose。
| 实验操作步骤
A 试剂制备
1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将 5X 的 Assay/Lysis 缓冲液稀释成 1X 的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制剂如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。
B 样品处理
贴壁细胞
1.培养细胞密度达到大约 80%-90%之间（直径 10 cm 培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制剂进行处理.
2.吸去培养基并用冰冷的 PBS 洗涤两次。
3.向细胞中加入 1X Assay/Lysis 缓冲液（每个直径 10cm 的组织培养皿中加入 0.5-1mL）。
4.将培养皿放置于冰上处理 10-20 分钟。
5.用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
6.将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7.如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用 27½的注射器针头来回吸取 3-4 次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。
8.4°C 12000 g, 离心 10 min。
9.收集上清（~1-2 mg 总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C 条件下。
悬浮细胞
1.培养细胞并用活化剂或抑制剂进行处理。
2.计数细胞后离心。
3.吸去培养基并用冰冷的 PBS 洗涤两次。
4.向细胞中加入 1X Assay/Lysis 缓冲液（每个直径 10cm 的组织培养皿中加入 0.5-1mL）。
5.反复吹打细胞进行裂解。
6.将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7.如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用 27½的注射器针头来回吸取 3-4 次，以破坏基因组DNA,从而避免上述情况的出现。
8.4°C 12000 g, 离心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C 条件下。
C.体外用GTPγS/GDP处理蛋白以用作阳性和阴性的对照(可选）
注意：在细胞体内环境条件下大约有 10%的 Rab4A `被激活，而在体外用 GTPγS 处理大约有90%的 Rab4A 被激活。
1. 准备两个离心管，每个管中各加入 0.5 mL 的细胞提取物（如果是纯的 Rab4A 蛋白则每个管中加入的蛋白量为 1ug）。
2. 每个管中加入 20ul 0.5M EDTA(终浓度即为 20 mM)。
3. 一个管中加入 5ul 的 100X GTPγS（终浓度即为 100 uM）作为阳性对照。另一个管中加入 5ul 的 100X GDP（终浓度即为 1 mM）作为阴性对照。
4. 将离心管置于 30°C 条件下反应 30 min 并不断搅动。
5. 终止反应：将管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(终浓度即为 60mM)。
D.激活 Rab4A 的亲和沉淀
1. 加入 0.5-1 mL(总蛋白的含量大约为 1mg)的细胞裂解物至微量离心管中。
2. 用1X Assay/Lysis 缓冲液。把每个样品的总体积调整到1ml
3. 向管中加入 1ul 的活性 Rab4A 单克隆抗体。(Cat.# NL23015)
4. 用涡旋振荡仪将 protein A/G 凝胶柱充分混匀，
5 .然后快速的吸出 20ul 悬浮珠浆液加入离心管中。
6. 将管置于 4°C 条件下孵育1小时，并轻轻的进行摇动。
7. 5000g，离心 1 分钟。
8. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。
9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。
10. 最后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。
11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 样品缓冲液重悬样品。
12. 样品煮沸 5min。
13. 5000g，离心 10s。
E. 蛋白印迹实验
1. 取 15ul 样品/孔上样 17%配体胶。
2. 按照制造商的说明进行 SDS-PAGE。
3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到 PVDF 或硝化纤维素膜。
4. 将 PVDF 膜浸