| 用途

 

    该试剂盒用于体外定量检测血清、血浆。组织匀浆，细胞裂解液，细胞培养上清，或其他相关生物液体中天然cGMP浓度。

 

---

 

| 基本性能

      

性能
灵敏度	18.4 fmol/ml
检测范围	0.08pmol/ml-250pmol/ml
特异性	可检测样本中cGMP (环磷酸鸟苷）的含量。且与其他类似物无明显交叉反应。
重复性	板内，板间变异系数均《10%

 

 

| 产品说明

 

       cGMP 是小分子的环状核苷酸，以微量存在于动植物细胞和微生物中，被称其为细胞内的第二信使（激素为第一信使）。cGMP 由鸟苷酸环化酶产生，被磷酸二酯酶降解，因此激活鸟苷酸环化酶 或者抑制磷酸二酯酶，可以提高细胞内 cGMP 的含量。研究发现，cGMP 特异性磷酸二酯酶的抑制剂可用于人类疾病的治疗。如：cGMP 特异性磷酸二酯酶类型5可用于治疗 ED 等疾病。 cGMP 分子量只有345.21。所以cGMP的定量分析多采用竞争结合法,且cGMP在机体内的含量极低，为 pmol/L 级别，所以一种灵敏度高，特异性强。重复性高的 cGMP ELISA 检测试剂盒是广大 科研工作者，最理想的选择。
      本公司开发了一种基于鼠单克隆抗体的 cGMP ELISA 检测试剂盒。该单克隆抗体对cGMP的 特异性比cGMP、ATP等类似的小分子高出108 倍以上。相较于其他的多克隆抗体cGMP试剂盒 ，我公司的 cGMP ELISA试剂盒能显著的提高其灵敏性和特异性 ，且能有效避免来自动物多克隆抗体的批次间差异 因此可以提供长久有效地可重复性定量检测。

 

 

---

 

| 实验原理

 

         本试剂盒利用竞争酶联免疫分析方法来测定细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的 cGMP 的水平。包被羊抗鼠多克隆抗体在酶标板上，细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cGMP 与固定数量的标记辣根过氧化物酶的 cAMP 竞争性的结合抗 cAMP单克隆抗体，采用已知浓度的 cGMP 标准品来做标准曲线。用酶标仪 在 450 nm 波长处测 OD 值，cGMP 浓度与 OD450值之间呈反比，通过绘制标准曲线计算出样品中 cGMP 的浓度。 

 

 

---

 

| 研究背景

     

    cGMP作为独特的第二信使 ,可调节细胞对各种外源和内源信号分子的反应. cGMP主要通过 激活蛋白激酶,控制特定的离子通道,磷酸二酯酶调节细胞环核苷酸浓度来调节不同的生理过程 ,如血管平滑肌松弛,上皮细胞电解质运输, 骨生长, 白细胞迁移, 轴突引导, 精子运动, 血小板蔓延以及血管通透性等。
    通过鸟苷酸环化酶可以实现GTP转化为cGMP。在哺乳动物中 ，存在2种类型的鸟苷酸环化酶: 可溶性及膜结合的鸟苷酸 环化酶(8,10,11)。可溶性环化酶在一氧化氮与血红素辅基结合后 ，即被激 活。七层膜结合鸟苷酸环化酶 (即跨膜鸟苷酸环化酶或鸟苷酸环化酶微粒) 已被证实存在于人类基 因组中 ，鸟苷酸环化酶A和B是利尿钠肽受体 ，鸟苷酸环化酶C能被热稳定细菌肠毒素、鸟苷素和脲 激活。跨膜鸟苷酸环化酶的活性亦受胞内信号通路的其他受体信号所调控。

 

| 试剂盒组份及保存

 

         

中文名称	规格	开封后保存条件
ELISA 酶标板    Goat anti-Mouse IgG Coated                        plate of 96 wells	96T: 8孔 x12 条                     48T: 8孔 x 6  条	2-8℃    90天
Assay Buffer A	96T:  1x6ml 48T:  1X3ml	2-8℃    90天
0.1M HCl	96T:  1X30ml                     48T:  1X15ml	2-8℃    90天
cGMP 标准品           cGMP Standard	96T: 1x0.1ml                     48T: 1X0.05ml                   (5000pmol/ml)	-80℃   180天
10XAssay Buffer	96T: 1x15ml  48T: 1x7.5ml	2-8℃    90天
浓缩cGMP 鼠单抗（1000x) Anti- cGMP monoclonal antibody (1000 X)	96T:  1x6ul                     48T:  1x3ul	-80℃   180天
浓缩 cGMP-HRP (1000x) HRP conjugated with cGMP (1000x)	96T: 1x6ul                     48T: 1x3ul	-80℃   180天
显示液A          substrate A	96T:1x12ml                     48T:1x6ml	2-8℃ (避光）90天
显示液B          substrate B	96T:1x12ml                     48T:1x6ml	2-8℃ (避光）90天
终止液          stop solution	96T:  1x6ml                     48T:  1x3ml	2-8℃    90天
封板覆膜           Plate Sealer	3个
产品说明书               Manual	1份

 

 

注：收到试剂盒后 ，若不立即使用 ，请按照标签说明存储在相应的温度。CAMP-HRP 浓缩液，及A,B显色液应避光保存。

 

| 试剂盒所需自备物品

 

 

 

---

 

| 样品处理

 

组织样本：需预先冰冻于液氮中。在不锈钢研钵中用液氮将组子样本研磨成精细粉末。待液氮挥发完后 ，称量冰冻组织样本并加入10倍体积的0.1M  

HCl混匀。室温以大于600g离心力离心 ，取上 层清夜用0.1M HCl稀释至适当浓度。

细胞样本：首先移除培养基 ，然后加入0.1M HCl处理细胞。孵育10分钟 并观察细胞是否被裂解；如果裂解充分 ，接着孵育10分钟并观察，以大于

600g离心力于室温离心 ，收集上清直接用于实验。  临用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%浓度的Triton-x 100可增强细胞和组织裂解。

尿液，血浆和培养液 ： 每1ml样品中加入1.2ml (0.1Mol) 盐酸混匀后，室温离心5min（600 g）留上清，用于本试剂盒检测。因为，血浆、血清、全血和组织匀浆通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它们会干扰实验。用0.1 M HCl处理样品，可以灭活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的浓度，能更加精准的检测样本中cGMP的浓度。 

 

备注：我公司的试剂盒，适用于检测经过盐酸处理的样品，因内源性磷酸二脂酶具有水解细胞内第二信使 cGMP浓度。而用0.1M盐酸处理样本可以终止内源性磷酸二脂酶的活性能更加精准的检测样本中cGMP的 水平。 

 

|  试剂盒注意事项

 

1. 收到试剂盒后若不立即使用 ，请将试剂按照标签说明存储在相应的温度 ，  -80℃低温保存的抗体和 酶储液为避免反复冻融请按每次需要量进行分装冻存；若立即使用，请将整个试剂盒置于4℃保存。

2. 使用前请将试剂盒各个试剂平衡到室温  (至少30min)  。

3. 用试剂预先润洗枪头在使用；取各种样品、标准品和试剂必需更换枪头。

4. 移取标准品和样品到微孔底部。

5. 从微孔的边缘加入试剂 ，以避免污染。

6. 本试剂盒使用可拆分的微孔酶标条 ，使用者可根据样品量多少进行拆分。未使用的酶标条保持干 燥 ，密封于试剂盒提供的铝封袋中 ，于4℃保存。微孔酶标条需安装在相应的框架上使用。

7. 在加入显色底物前 ，确保微孔内没有残留的洗涤液。微量残留的洗涤液可能导致分析结果的变化。

 

| 检测前准备工作

 

1.  提前30分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(18-25℃)。如果试剂盒需分 多次使用，请仅取出本次实验所需的酶标板条和试剂，剩余板条和试剂需 按照指定条件保存。

 

2.  1x Assay Buffer：将15 mL 10× Assay Buffer加到135 mL去离子水中 ，稀释成工作液。稀释液可在室温保存至试剂盒有效期限 ，或者3个月。

 

3. CGMP标准品工作液：将5000 pmol/mL cGMP标准品溶液平衡至室温。然后根据需要进行倍比稀释。倍比稀释方法：从#1至#7标记七只洁净试管。移取475μ L 0.1M HCl到#1号试管 ，400μ L到#2至#7号试管。加入25μ L 5000 pmol/mL cGMP标准品到#1管中 混匀配置成250pmol/ml 的标准品工作液。从#1管中取出100μ L溶液至#2管中，混匀。以此类推 ，重复上步操作 ，梯度稀释至#6 管。经以上操作 ，#1至#6管中cGMP标准品浓度分别为250, 50，10,  2. ,0.4 和 0.08 pmol/mL  (详见下图)  。提示：最后一管 #7直接作为BO孔(0 pmol/mL cGMP标准品)。，不需要再从#6管中吸取液体。 稀释过的标准品需在30分钟内使用。

 

 

 

              

4.cGMP-HRP Conjugate工作液：实验前计算当次实验所需用量 （以50ul/孔计算)  ，实际配置时应多配置100-200ul.使用15分钟，用配好的1x Assay Buffer,将cGMP-HRP Conjugate （1000×) 稀释成1x工作浓度。当日使用。

                

 5.Anti-cGMP Monoclonal Antibody工作液：  实验前计算当次实验所需用量  (以50ul/孔计算)  ，实际配置时应多配置100-200ul.使用前15分钟 ，用配好的1x Assay Buffer,将 Anti-cGMP Monoclonal Antibody ( 1000×)  稀释成1x工作浓度当日使用。

 

|  实验步骤

      

1.分别设定 标准孔，BO孔 (0 pmol/mL cGMP标准品)，Blank孔（空白孔） 样品孔，建议全部设立复孔（参照下图2） 待测样品孔，可视实际需要，  酌情考虑。
2.移取50μ L  Assay Buffer A至各个微孔中 ，除Blank(空白)孔外。
3. 移取100μ L 0.1M HCl至B0孔(0 pmol/mL cGMP标准品)。
4. 移取100μ L 倍比稀释的cGMP标准品至相应的各标准孔。
5. 移取100μ L样品至相应的各样品孔。
6. 移取50μ L 偶联酶至各孔中，除了Blank(空白)孔。
7. 移取50μ L 抗体工作液至各孔中 ，除了Blank(空白)孔。
8. 给酶标板覆膜，室温孵育1小时。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制10分钟。
9  在吸水纸上拍干微孔内溶液 ，加1x Assay Buffer 250μ L每孔洗3次 ，每次需拍干。

10.最后一次洗涤 ，清空各微孔 ，在干净的无尘吸水纸上轻巧酶标板数次,以确保没有洗涤液残留。
11.每孔 200μ L显色底物溶液 ,于室温避光孵育10分钟。(显色底物A和B需在临用前15分钟内等体积混合,并避光放置）提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时(前4个显色孔出现明显蓝色梯度)，即可终止。提前15分钟打开酶标仪预热。
12. 每孔加入50μ L终止液。终止反应。
13. 立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度(OD值)。

 

|  操作流程图

 

                  

                                    

                                                                                   图一

                  

         

            

                                                                                  图二

 

| 结果判断

   

  1. ELISA的样本通常要设置1~2个复孔进行检测，分别求出标准品、实验组样本的吸光度的平均值。单个样本的检测值不应超出平均值的20%

   2. 用软件ELISA Calc  的logistic 曲线拟合2（四参数）建立标准曲线（X轴上为标准品浓度，Y轴为对应的OD值）
   3. 若样品OD值低于标准曲线下限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

 

| 典型数据

 

 由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差 异。
 以下数据和曲线仅供参考，实验者需要根据自己的实验建立标准曲线。

 

 

           

   

               

|     ELISA 结果计算（点击下载）                                        

 

|     cGMP ELISA  试剂盒性能分析（点击下载）