| 用途
体内 Gαi 激活水平的分析。
检测增强 Gαi 活性的化合物和蛋白质。
检测抑制 Gαi 活性的化合物和蛋白质。
对细胞（组织）中的 Gαi 活性进行定位、定性、定量研究。
| 产品说明
光子到大肽，结构多样化的配体激活G蛋白偶联受体(GPCRs)的生理功能。配体结合的GPCRs作为鸟嘌呤核苷酸交换因子，在Gβγ存在的情况下，催化Gα亚基上的GDP与GTP交换，导致Gα亚基从Gβγ二聚体解离，形成两个功能单元(Gα和Gβγ)。Gα和Gβγ亚基都向各种细胞信号转导通路。根据序列和功能同源性，G蛋白可分为4个家族:Gs、Gi、Gq和G12。Gαi家族(包括Gαz)是G蛋白中最大的家族。它们传递GPCRs的信号来调节各种生物功能。目前还没有直接的方法来测量受体对Gαi蛋白的激活(直到这个试剂盒)。大多数报告使用下游途径之一，即腺苷酸环化酶的抑制作为读数。
而77779193永利推出的 Gαi 活性检测试剂盒主要是依据单克隆抗体能够特异性的识别特殊构象的Gαi- GTP 结合蛋白，而不识别Gαi -GDP结合蛋白，进而简单并且快速的进行 Gαi 的活性检测。每个试剂盒可以进行 30 次免疫亲和沉淀检测。同时试剂盒中的 Gαi -GTP 单克隆抗体也可以通过免疫组化和免疫荧光对细胞和组织中的 Gαi 的活性进行监测。
| 检测原理
77779193永利的 Gαi 活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的 Gαi- GTP 单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行 GTPγS 活化处理）活性Gαi- GTP 的水平。简言之，特异性识别 Gαi 活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的Gαi- GTP 活性蛋白，然后利用 Protein A/G 将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用识别 Gαi 的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。
| 试剂盒组份及储存
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名称 |
货号 |
规格 |
储存温度 |
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Anti-active Gαi Mouse Monoclonal antibody |
Cat.#NL23012 |
1x35ul |
-20℃ |
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Protein A/G Agarose |
Cat.#NL30301 |
1x600ul |
4℃ |
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5xAssay/ lysis Buffer |
Cat.#NL30303 |
1x30ml |
4℃ |
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Anti-Gαi Rabbit polyclonal antiboy |
Cat.#NL24012 |
1x50ul |
-20℃ |
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100xGTP-rS |
Cat.#NL30302 |
1x50ul |
-80℃ |
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100XGDP |
Cat.#NL30304 |
1x50ul |
-80℃ |
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HRP-Goat anti-Rabbit IgG |
Cat.#NL29002 |
1x50ul |
-20℃ |
注意:使用前应将100xGTP-rs和100xGDP 分装成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 冻存，避免反复冻融。
试剂盒所需自备物品。
1.刺激和未刺激的细胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制剂；
3. 4 °C 摇杆或者摇床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 电泳和免疫印迹相关试剂；
8. 免疫印迹缓冲液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；
9. 免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；
10 ECL 检测试剂；
试剂盒注意事项
1.收到试剂盒后如不立即使用，请将试剂盒组分按照标签说明存储在相应的温度，100xGTP-rs和100xGDP 分装成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 冻存，避免反复冻融。
2.Protein A/G Agarose使用前请稍微离心甩一下，因管壁上可能残留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇挥发，体积较少时很难将Agarose吹散，所以请补充20%乙醇等于Agarose的体积。
3.使用50% 的Protein A/G Agarose前先用枪将其吹匀，一个反应管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足够。
4. 将50% 的Protein A/G Agarose加入反应管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗涤3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合适体积的1×Assay/Lysis Buffer悬浮Agarose，再分装于 反应管，保证每管参与反应的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。
5. 为了减少50% 的Protein A/G Agarose的损失，可以先在反应管中加入适当体积的1×Assay/Lysis Buffer。
6. 反应管中试剂加入顺序建议，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀释的Protein A/G Agarose，细胞裂解液和活性抗体，总体积建议0.5ml-1ml
7. 活性抗体的加入量请适当做调整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。
8. 孵育反应在4℃ 360度摇床进行。
9. 反应完毕，洗涤Agarose时候，尽量避免吸走Agarose。
| 实验操作步骤
A 试剂制备
1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将 5X 的 Assay/Lysis 缓冲液稀释成 1X 的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制剂如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。
B 样品处理
贴壁细胞
1.培养细胞密度达到大约 80%-90%之间（直径 10 cm 培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制剂进行处理.
2.吸去培养基并用冰冷的 PBS 洗涤两次。
3.向细胞中加入 1X Assay/Lysis 缓冲液（每个直径 10cm 的组织培养皿中加入 0.5-1mL
