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| 用途

 

    体内 Rab4A 激活水平的分析。

    检测增强 Rab4A 活性的化合物和蛋白质。

    检测抑制 Rab4A 活性的化合物和蛋白质。

    对细胞（组织）中的 Rab4A 活性进行定位、定性、定量研究。

 

 

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| 产品说明

 

     Rab4是一种进化上保守的GTP结合蛋白，主要定位于网格包被囊泡、早期内体和循环内体，是细胞内吞、循环过程的重要调节因子. Rab4包括Rab4A、Rab4B和Rab4C  3个不同的亚型. Rab4在结合GDP或水解GTP之间不断转换变化，介导胞膜表面蛋白的快速内吞、分选与循环运输，影响囊泡定向运动所需的分子间相互作用.目前尚无直接测定Rab4-GTP活性的方法。

     

     77779193永利的 Rab4A 活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的 Rab4-GTP 单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行 GTPγS 活化处理）活性 Rab4-GTP 的水平。简言之特异性识别 Rab4A 活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的 Rab4A-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G 将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用特异性识别 Rab4A 的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。每个试剂盒可以进行30次免疫亲和沉淀检测 ，同时试剂盒中的 Rab4A- GTP 单克隆抗体也可以通过免疫组化和免疫荧光实验对细胞和组织中Rab4A的活性进行监测。

 

 

 

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| 检测原理

 

         77779193永利的 Rab4A 活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的 Rab4A-GTP 单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行 GTPγS 活化处理）活性Rab4A-GTP的水平。简言之，特异性识别 Rab4A 活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的 Rab4A-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用特异性识别 Rab4A 的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。

 

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| 试剂盒组份及储存

 

 

名称	货号	规格	储存温度
Anti-active Rab4A mouse Monoclonal antibody	Cat.#NL23015	1x35ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#NL30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lysis Buffer	Cat.#NL30303	1x30ml	4℃
Anti-Rab4A Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#NL24015	1x50ul	-20℃
100xGTP-rS	Cat.#NL30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#NL30304	1x50ul	-80℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#NL29002	1x50ul	-20℃

 

注意:使用前应将100xGTP-rs和100xGDP 分装成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 冻存，避免反复冻融。

 

试剂盒所需自备物品。

 

1.刺激和未刺激的细胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制剂；

3. 4 °C 摇杆或者摇床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 电泳和免疫印迹相关试剂；

8. 免疫印迹缓冲液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 检测试剂；

 

试剂盒注意事项

 

1.收到试剂盒后如不立即使用，请将试剂盒组分按照标签说明存储在相应的温度，100xGTP-rs和100xGDP 分装成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 冻存，避免反复冻融。 

2.Protein A/G Agarose使用前请稍微离心甩一下，因管壁上可能残留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇挥发，体积较少时很难将Agarose吹散，所以请补充20%乙醇等于Agarose的体积。

3.使用50% 的Protein A/G Agarose前先用枪将其吹匀，一个反应管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足够。

4. 将50% 的Protein A/G Agarose加入反应管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗涤3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合适体积的1×Assay/Lysis Buffer悬浮Agarose，再分装于 反应管，保证每管参与反应的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。

5. 为了减少50% 的Protein A/G Agarose的损失，可以先在反应管中加入适当体积的1×Assay/Lysis Buffer。

6. 反应管中试剂加入顺序建议，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀释的Protein A/G Agarose，细胞裂解液和活性抗体，总体积建议0.5ml-1ml

7. 活性抗体的加入量请适当做调整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。

8. 孵育反应在4℃ 360度摇床进行。

9. 反应完毕，洗涤Agarose时候，尽量避免吸走Agarose。

 

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| 实验操作步骤

 

A    试剂制备

 

1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将 5X 的 Assay/Lysis 缓冲液稀释成 1X 的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制剂如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B    样品处理

 

        贴壁细胞

 

1.培养细胞密度达到大约 80%-90%之间（直径 10 cm 培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制剂进行处理. 

2.吸去培养基并用冰冷的 PBS 洗涤两次。

3.向细胞中加入 1X Assay/Lysis 缓冲液（每个直径 10cm 的组织培养皿中加入 0.5-1mL）。

4.将培养皿放置于冰上处理 10-20 分钟。

5.用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

6.将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7.如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用 27½的注射器针头来回吸取 3-4 次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。

8.4°C 12000 g, 离心 10 min。

9.收集上清（~1-2 mg 总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C 条件下。

 

        悬浮细胞

 

1.培养细胞并用活化剂或抑制剂进行处理。

2.计数细胞后离心。

3.吸去培养基并用冰冷的 PBS 洗涤两次。

4.向细胞中加入 1X Assay/Lysis 缓冲液（每个直径 10cm 的组织培养皿中加入 0.5-1mL）。

5.反复吹打细胞进行裂解。

6.将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7.如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用 27½的注射器针头来回吸取 3-4 次，以破坏基因组DNA,从而避免上述情况的出现。    

8.4°C 12000 g, 离心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C 条件下。

 

C.体外用GTPγS/GDP处理蛋白以用作阳性和阴性的对照(可选）

 

注意：在细胞体内环境条件下大约有 10%的 Rab4A `被激活，而在体外用 GTPγS 处理大约有90%的 Rab4A 被激活。 

1. 准备两个离心管，每个管中各加入 0.5 mL 的细胞提取物（如果是纯的 Rab4A 蛋白则每个管中加入的蛋白量为 1ug）。

2. 每个管中加入 20ul 0.5M EDTA(终浓度即为 20 mM)。

3. 一个管中加入 5ul 的 100X GTPγS（终浓度即为 100 uM）作为阳性对照。另一个管中加入 5ul 的 100X GDP（终浓度即为 1 mM）作为阴性对照。

4. 将离心管置于 30°C 条件下反应 30 min 并不断搅动。

5. 终止反应：将管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(终浓度即为 60mM)。 

 

D.激活 Rab4A 的亲和沉淀

 

1. 加入 0.5-1 mL(总蛋白的含量大约为 1mg)的细胞裂解物至微量离心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 缓冲液。把每个样品的总体积调整到1ml 

3. 向管中加入 1ul 的活性 Rab4A 单克隆抗体。(Cat.# NL23015)

4. 用涡旋振荡仪将 protein A/G 凝胶柱充分混匀，

5 .然后快速的吸出 20ul 悬浮珠浆液加入离心管中。

6. 将管置于 4°C 条件下孵育1小时，并轻轻的进行摇动。

7. 5000g，离心 1 分钟。

8. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。

10. 最后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 样品缓冲液重悬样品。

12. 样品煮沸 5min。 

13. 5000g，离心 10s。

 

E. 蛋白印迹实验 

 

1. 取 15ul 样品/孔上样 17%配体胶。

2. 按照制造商的说明进行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到 PVDF 或硝化纤维素膜。 

4. 将 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室温放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纤维 素膜，此步省略。 

5. 封闭； 用 TBST 缓冲液配制 5%的脱脂牛奶或者 3%BSA 在室温下孵育 1小时进行封闭，并需要恒定振荡。 

6 用 TBST 缓冲液洗涤膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 缓冲液配制的 5%脱脂牛奶或 3%BSA Anti-Rab4A pAb (Cat.#NL23015),稀释比例为 1:50-1:1000，主要根据样品中含有的 Rab4A 蛋 的量）室温下孵育 1-2 小时，或者 4°C 条件下过夜孵育.

8. 用 TBST 缓冲液洗涤膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 缓冲液配制的 5%脱脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀释比例稀释后使用，室温下孵育 1 小时并恒定振荡。

10. 用 TBST 缓冲液洗涤膜三次/5min。

11. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如 ECL 显色法。

 

   示例结果

 

下图展示的是本公司的 Rab4A 活性试剂盒的典型结果。下面的数据仅供参考。

                    

                     

              

                 

          

 

 

图一 ：细胞裂解物(500ul,1mg/ml （lane3) ,PDGF处理(lane1) 或GDP 处理（lane2) 与 ProteinA/G 和 Anti-Rab4A-GTP Monoclonal Antibody  (1ul ,1mg/ml  Cat #  NL23015)  进行孵育， 用 Anti- Rab4A rabbit polyclonal antibody (稀释比例，1:1000，Cat # NL24015)  进行蛋白印迹分析.

图二 :  细胞裂解物（20ul,  1mg/ml) 用 Anti- Rab4A rabbit polyclonal antibody (稀释比例，1:1000，Cat # NL24015)  进行蛋白印迹分析.

图三 :  细胞裂解物（20ul,  1mg/ml) 用 Anti- GAPDH rabbit polyclonal antibody (稀释比例，1:1000，Cat # NL28001)  进行蛋白印迹分析.

 

 

    

                    与传统的 GST- pull down 方法相比，该试剂盒具有以下明显优势

 

 

1. 灵敏度高；诱导蛋白与目标蛋白中的结合对蛋白量的要求比较高。而抗体与蛋白的结合对样本中蛋白的要求比较少。

2. 特异性强；因为诱饵蛋白是需要加上GST标签的重组蛋白，所以是非生理状态下的验证，蛋白质的结构和形式可能与天然状态下存在一定差异，而抗体与目标蛋白的结合 ，活细胞状态下蛋白质之间的相互作用被保持，所以其反映的是细胞中真实的蛋白情况.

3. 应用更为广泛；试剂盒中能够特异性识别GTP结合状态的三聚体G蛋白或者小G蛋白的单克隆抗体，适应各种种属（Human，Mouse，Rat，Rice plants，Pig Cotton，bacteria，Escherichia coli等）应用范围非常广泛（ IP ,WB ,IHC IF ICF,ICC,IHF.FC,Elisa 等）随着这些应用的普及，G 蛋白信号转导的研究进展，必将进一步加快。