| 用途
体内 Rab4A 激活水平的分析。
检测增强 Rab4A 活性的化合物和蛋白质。
检测抑制 Rab4A 活性的化合物和蛋白质。
对细胞（组织）中的 Rab4A 活性进行定位、定性、定量研究。
| 产品说明
Rab4是一种进化上保守的GTP结合蛋白，主要定位于网格包被囊泡、早期内体和循环内体，是细胞内吞、循环过程的重要调节因子. Rab4包括Rab4A、Rab4B和Rab4C 3个不同的亚型. Rab4在结合GDP或水解GTP之间不断转换变化，介导胞膜表面蛋白的快速内吞、分选与循环运输，影响囊泡定向运动所需的分子间相互作用.目前尚无直接测定Rab4-GTP活性的方法。
77779193永利的 Rab4A 活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的 Rab4-GTP 单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行 GTPγS 活化处理）活性 Rab4-GTP 的水平。简言之特异性识别 Rab4A 活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的 Rab4A-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G 将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用特异性识别 Rab4A 的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。每个试剂盒可以进行30次免疫亲和沉淀检测 ，同时试剂盒中的 Rab4A- GTP 单克隆抗体也可以通过免疫组化和免疫荧光实验对细胞和组织中Rab4A的活性进行监测。
| 检测原理
77779193永利的 Rab4A 活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的 Rab4A-GTP 单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行 GTPγS 活化处理）活性Rab4A-GTP的水平。简言之，特异性识别 Rab4A 活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的 Rab4A-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用特异性识别 Rab4A 的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。
| 试剂盒组份及储存
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名称 |
货号 |
规格 |
储存温度 |
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Anti-active Rab4A mouse Monoclonal antibody |
Cat.#NL23015 |
1x35ul |
-20℃ |
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Protein A/G Agarose |
Cat.#NL30301 |
1x600ul |
4℃ |
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5xAssay/ lysis Buffer |
Cat.#NL30303 |
1x30ml |
4℃ |
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Anti-Rab4A Rabbit polyclonal antiboy |
Cat.#NL24015 |
1x50ul |
-20℃ |
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100xGTP-rS |
Cat.#NL30302 |
1x50ul |
-80℃ |
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100XGDP |
Cat.#NL30304 |
1x50ul |
-80℃ |
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HRP-Goat anti-Rabbit IgG |
Cat.#NL29002 |
1x50ul |
-20℃ |
注意:使用前应将100xGTP-rs和100xGDP 分装成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 冻存，避免反复冻融。
试剂盒所需自备物品。
1.刺激和未刺激的细胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制剂；
3. 4 °C 摇杆或者摇床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 电泳和免疫印迹相关试剂；
8. 免疫印迹缓冲液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；
9. 免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；
10 ECL 检测试剂；
试剂盒注意事项
1.收到试剂盒后如不立即使用，请将试剂盒组分按照标签说明存储在相应的温度，100xGTP-rs和100xGDP 分装成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 冻存，避免反复冻融。
2.Protein A/G Agarose使用前请稍微离心甩一下，因管壁上可能残留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇挥发，体积较少时很难将Agarose吹散，所以请补充20%乙醇等于Agarose的体积。
3.使用50% 的Protein A/G Agarose前先用枪将其吹匀，一个反应管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足够。
4. 将50% 的Protein A/G Agarose加入反应管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗涤3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合适体积的1×Assay/Lysis Buffer悬浮Agarose，再分装于 反应管，保证每管参与反应的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。
5. 为了减少50% 的Protein A/G Agarose的损失，可以先在反应管中加入适当体积的1×Assay/Lysis Buffer。
6. 反应管中试剂加入顺序建议，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀释的Protein A/G Agarose，细胞裂解液和活性抗体，总体积建议0.5ml-1ml
7. 活性抗体的加入量请适当做调整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。
8. 孵育反应在4℃ 360度摇床进行。
9. 反应完毕，洗涤Agarose时候，尽量避免吸走Agarose。
| 实验操作步骤
A 试剂制备
1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将 5X 的 Assay/Lysis 缓冲液稀释成 1X 的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制剂如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。
B 样品处理
贴壁细胞
1.培养细胞密度达到大约 80%-90%之间（直径 10 cm 培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制剂进行处理.
2.吸去培养基并用冰冷的 PBS 洗涤两次。
3.向细胞中加入 1X A
