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| 用途

    本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中 5α，6α-环氧胆固醇酯（5α，6α-ECE）含量。

| 实验原理

   本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人 5α，6α-环氧胆固醇酯（5α，6α-ECE）水平。用纯化的人 5α，6α-环氧胆固醇酯（5α，6α-ECE）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 5α，6α-环氧胆固醇酯（5α，6α-ECE），再与 HRP 标记的5α，6α-环氧胆固醇酯（5α，6α-ECE）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 5α，6α-环氧胆固醇酯（5α，6α-ECE）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人 5α，6α-环氧胆固醇酯（5α，6α-ECE）浓度。

| 基本性能

| 试剂盒组份及储存

说明；未拆封的试剂盒可以在2-8℃ 保存六个月.

| 试剂盒所需自备物品。

 1.酶标仪(450nm波长滤光片) 

 2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

 3.37℃恒温箱 

 4. 双蒸水或去离子水 

 5. 吸水纸 

 6. 加样槽

| 样品收集方法（具体处理方法请咨询）

1.  血清：用无菌管收集，室温血液自然凝固10-20分钟，2-8℃条件离心20分钟左右  （2000-3000转/分）仔细收集上清，保存过程中  如出现沉淀，应再次离心。

2.  血浆：应根据标本的要求选择EDTA、肝素钠或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成应该再次离心。

3.  尿液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

4. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将剪碎的组织与 对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适 当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步 裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g 离心5-10分钟取 上清检测。

5.  细胞提取液：贴壁 细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞。悬浮 细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每106个细胞中加入150-200 μL PBS重悬(推荐在PBS 中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。

6. 细胞培养上清或其他生物体液；收集液体后于2-8℃，1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片，取上清检测。

| 试剂盒注意事项

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。 

2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 

3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 

4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品 稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（n×5) 

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 

6. 底物请避光保存。 

7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 

8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 

9. 本试剂不同批号组分不得混用。

|  样本收集注意事项

1. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2. 标本采集后尽快进行实验，若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3. 我们罗列的是通用的样本处理方法，无法涵盖各种样本，对于一些特殊样本，建议实验人员多参考已发表的文献，自行设计合理的样本 处理方法。

|  检测前准备工作

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。

2. 用双蒸水将30×浓缩洗涤液稀释成1×工作液。未用完的放回4 ℃。

3. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

|  操作步骤

1. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、  待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加 样 50μl，待测样品孔中先加样品稀释液. 40μl，然后再加待测样品 10μl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底 ）部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 

2. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。  

3. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此  重复 5 次，拍干。 

4. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。 

5. 温育：操作同 2 

6. 洗涤：操作同 3 

7. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟. 

8. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 

9. 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终 止液后15分钟以内进行。 

|  操作一览表  

|  结果判断

 1. 每个标准品和标本的OD 值应减去空白孔的OD值。

 2. 以标准品的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，利用计算机软件采用直线回归的拟合方法创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。

 3. 若样本的OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

 |  示例曲线

 由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。详情请看质检报告.