| 用途
本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中组织因子途径抑制物(TFPI)含量。
| 实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人组织因子途径抑制物(TFPI)水平。用纯化的人组织因子途径抑制物(TFPI)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入组织因子途径抑制物(TFPI)，再与 HRP 标记的组织因子途径抑制物(TFPI)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的组织因子途径抑制物(TFPI)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人组织因子途径抑制物(TFPI)浓度。
| 基本性能
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性能 |
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灵敏度 |
1.25μg/L
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检测范围 |
5μg/L -125μg/L
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特异性 |
可检测样本中的计算样品中人组织因子途径抑制物(TFPI)浓度。 且与其他类似物无明显交叉反应。
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重复性 |
板内，板间变异系数均《10%
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| 试剂盒组份及储存
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中文名称 |
规格 |
开封后保存条件 |
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ELISA 酶标板 |
96T : 8 孔×12 条 48T : 8 孔×6 条 |
2-8℃ 90天 |
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标准品 |
96T : 0.5ml x1 （240μg/L） 48T : 0.25mlx1 |
2-8℃ 90天 |
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HRP标记抗体 |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃ 90天 |
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样品稀释液 |
96T : 1.5mlx1 48T : 1mlx1 |
2-8℃ 180天 |
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标准品稀释液 |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃ 180天 |
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显色剂A |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃(避光） 180天 |
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显色剂B |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃(避光） 180天 |
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终止液 |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃ 180天 180天 |
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30倍浓缩洗涤液 |
96T : 20mlx1 48T : 10mlx1 |
2-8℃ 180天 180天 |
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说明书 |
1份 |
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质检报告 |
1份 |
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密封袋 |
1个 |
说明；未拆封的试剂盒可以在2-8℃ 保存六个月.
| 试剂盒所需自备物品。
1.酶标仪(450nm波长滤光片)
2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3.37℃恒温箱
4. 双蒸水或去离子水
5. 吸水纸
6. 加样槽
| 样品收集方法（具体处理方法请咨询）
1. 血清：用无菌管收集，室温血液自然凝固10-20分钟，2-8℃条件离心20分钟左右 （2000-3000转/分）仔细收集上清，保存过程中 如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、肝素钠或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
4. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将剪碎的组织与 对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适 当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步 裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g 离心5-10分钟取 上清检测。
5. 细胞提取液：贴壁 细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞。悬浮 细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每106个细胞中加入150-200 μL PBS重悬(推荐在PBS 中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。
6. 细胞培养上清或其他生物体液；收集液体后于2-8℃，1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片，取上清检测。
| 试剂盒注意事项
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品 稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（n×5)
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
| 样本收集注意事项
1. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
2. 标本采集后尽快进行实验，若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3. 我们罗列的是通用的样本处理方法，无法涵盖各种样本，对于一些特殊样本，建议实验人员多参考已发表的文献，自行设计合理的样本 处理方法。
| 检测前准备工作
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。
2. 用双蒸水将30×浓缩洗涤液稀释成1×工作液。未用完的放回4 ℃。
3. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
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120μg/L
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5号标准品 |
150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液 |
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60μg/L
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4号标准品 |
150μl 的5号标准品加入150μl 标准品稀释液 |
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30μg/L
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3号标准品 |
150μl 的4号标准品加入150μl 标准品稀释液 |
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15μg/L
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2号标准品 |
150μl 的3号标准品加入150μl 标准品稀释液 |
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7.5μg/L
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1号标准品 |
150μl 的2号标准品加入150μl 标准品稀释液 |
| 操作步骤
1. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加 样 50μl，待测样品孔中先加样品稀释液. 40μl，然后再加待测样品 10μl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底 ）部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
3. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。
4. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。
5. 温育：操作同 2
6. 洗涤：操作同 3
7. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.
8. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
9. 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终 止液后15分钟以内进行。
| 操作一览表
| 结果判断
1. 每个标准品和标本的OD 值应减去空白孔的OD值。
2. 以标准品的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，利用计算机软件采用直线回归的拟合方法创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。
3. 若样本的OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
| 示例曲线
由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。详情请看质检报告.
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18674031376
