| 用途

 

    该试剂盒用于体外定量检测血清、血浆,组织匀浆，细胞裂解液，细胞培养上清，或其他相关生物中液体的天然cGMP浓度。

 

    灵敏度：14fmol/ml               检测范围：0.016pmol/ml-250pmol/ml

 

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| 产品说明

 

      cGMP 是小分子的环状核苷酸，以微量存在于动植物细胞和微生物中，被称其为细胞内的第二信使（激素为第一信使）。cGMP 由鸟苷酸环化酶产生，被磷酸二酯酶降解，因此激活鸟苷酸环化酶 或者抑制磷酸二酯酶，可以提高细胞内 cGMP 的含量。研究发现，cGMP 特异性磷酸二酯酶的抑制剂可用于人类疾病的治疗。如：cGMP 特异性磷酸二酯酶类型5可用于治疗 ED 等疾病。 cGMP 分子量只有345.21。所以cGMP的定量分析多采用竞争结合法,且cGMP在机体内的含量极低，为 pmol/L 级别，所以一种灵敏度高，特异性强。重复性高的 cGMP ELISA 检测试剂盒是广大 科研工作者，最理想的选择。

     

     本公司开发了一种基于鼠单克隆抗体的 cGMP ELISA 检测试剂盒。该单克隆抗体对cGMP的 特异性比cGMP、ATP等类似的小分子高出108 倍以上。相较于其他的多克隆抗体cGMP试剂盒 ，我公司的 cGMP ELISA试剂盒能显著的提高其灵敏性和特异性 ，且能有效避免来自动物多克隆抗体的 批次间差异 因此可以提供长久有效地可重复性定量检测。

       

      

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| 实验原理

 

      我们公司试剂盒利用竞争酶联免疫分析方法来测定细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的 cGMP 的水平。包被羊抗鼠多克隆抗体在酶标板上，细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中 的 cGMP与固定数量的标记辣根过氧化物酶的 cGMP 竞争性的结合抗 cGMP 单克隆抗体， 采用已知浓度的 cGMP 标准品来做标准曲线。检测450nm 波长下的 OD 值，吸光度 OD 值与 样品中 cGMP 的浓度呈反比关系。基于 cGMP 标准品所得曲线，通过测得OD值可以计 算出样品中 cGMP 的浓度。

 

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| 研究背景

     

      cGMP作为独特的第二信使 ,可调节细胞对各种外源和内源信号分子的反应. cGMP主要通过 激活蛋白激酶,控制特定的离子通道,磷酸二酯酶调节细胞环核苷酸浓度来调节不同的生理过程 ,如血管平滑肌松弛,上皮细胞电解质运输, 骨生长, 白细胞迁移, 轴突引导, 精子运动, 血小板蔓延以及血管通透性等。

      通过鸟苷酸环化酶可以实现GTP转化为cGMP。在哺乳动物中 ，存在2种类型的鸟苷酸环化酶:  可溶性及膜结合的鸟苷酸 环化酶(8,10,11)。可溶性环化酶在一氧化氮与血红素辅基结合后 ，即被激 活。七层膜结合鸟苷酸环化酶  (即跨膜鸟苷酸环化酶或鸟苷酸环化酶微粒)  已被证实存在于人类基 因组中 ，鸟苷酸环化酶A和B是利尿钠肽受体 ，鸟苷酸环化酶C能被热稳定细菌肠毒素、鸟苷素和脲 激活。跨膜鸟苷酸环化酶的活性亦受胞内信号通路的其他受体信号所调控。

 

 

| 试剂盒组份及保存

 

         

 

 注：收到试剂盒后 ，若不立即使用 ，请按照标签说明存储在相应的温度。

 

| 试剂盒所需自备物品

 

1.去离子水或蒸馏水。

2. 浓盐酸。

3. 量程在5μ L至1000μ L之间的精密移液管。

4. 量程为50μ L和200μ L的中继移液器。

5. 用于稀释储液的一次性烧杯。

6. 刻度量筒。

7. 微孔板振荡器。

8. 吸水纸。

9. 酶标仪 ，可读波长450nm ，在570nm至590nm之间应有修正。

 

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| 样品处理

 

组织样本：需预先冰冻于液氮中。在不锈钢研钵中用液氮将组子样本研磨成精细粉末。待液氮挥发完后 ，称量冰冻组织样本并加入10倍体积的0.1M  

HCl混匀。室温以大于600g离心力离心 ，取上 层清夜用0.1M HCl稀释至适当浓度。

细胞样本：首先移除培养基 ，然后加入0.1M HCl处理细胞。孵育10分钟 并观察细胞是否被裂解；如果裂解充分 ，接着孵育10分钟并观察，以大于

600g离心力于室温离 心 ，收集上清直接用于实验。  临用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%浓度的Triton-x 100可增强细胞 和组织裂解。

尿液，血浆和培养液：每ml样品中加入10µL浓盐酸（12M）混匀后，室温离心5min（600 g）留上清，用于本试剂盒检测。血浆、血清、全血和组织匀浆通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它们会干扰实验。用0.1 M HCl处理样品，可以灭活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的浓度，使之可以用于本试剂盒。

 

备注：内源性磷酸二脂酶具有水解细胞内第二信使 cGMP浓度。而用0.1M盐酸处理样本可以终止内源性磷酸二脂酶的活性。能更加精准的检测样本中cGMP的浓度。

 

|  试剂盒注意事项

 

1. 收到试剂盒后若不立即使用 ，请将试剂按照标签说明存储在相应的温度 ，  -80℃低温保存的抗体和 酶储液为避免反复冻融请按每次需要量进行分装冻存；若立即使用，请将整个试剂盒置于4℃保存。

2. 使用前请将试剂盒各个试剂平衡到室温  (至少30min)  。

3. 用试剂预先润洗枪头在使用；取各种样品、标准品和试剂必需更换枪头。

4. 移取标准品和样品到微孔底部。

5. 从微孔的边缘加入试剂 ，以避免污染。

6. 本试剂盒使用可拆分的微孔酶标条 ，使用者可根据样品量多少进行拆分。未使用的酶标条保持干 燥 ，密封于试剂盒提供的铝封袋中 ，于4℃保存。微孔酶标条需安装在相应的框架上使用。

7. 在加入显色底物前 ，确保微孔内没有残留的洗涤液。微量残留的洗涤液可能导致分析结果的变化。

 

| 试剂准备

 

1.CGMP标准品工作液

 

     将5000 pmol/mL cGMP标准品溶液平衡至室温。从#1至#6标记六只洁净试管。移取475μ L 0.1M HCl到#1号试管 ，400μ L到#2至#7号试管。加入25μ L 5000 pmol/mL cGMP标准品到#1管中 ，剧烈涡旋震荡。从#1管中取出100μ L溶液至#2管中 ，涡旋震荡。以此类推 , 重复上步操作 ,梯度稀释至#7管。经以上操作 ，#1至#7管中cAMP标准品浓度分别为250, 50，10,  2. ,0.4 , 0.08   和 0.016 pmol/mL  (详见 cGMP实验稀释操作流程图)  。稀释过的标准品需在30分钟内使用。标记一只试管作为无标准品空白对照  ( B0)  。移取600μ L 0.1M HCl 到 BO管中。

              

                           

                                  

 

2.1x Assay Buffer

                

     将15 mL 10×Assay Buffer加到135 mL去离子水中 ，稀释成工作液。稀释液可在室温保存至试剂盒有效期限 ，或者3个月。

 

3.cGMP-HRP Conjugate工作液

      

    实验前计算当次实验所需用量  (以50ul/孔计算)  ，实际配置时应多配置100-200ul.使用前15 分钟 ，用配好的1x Assay Buffer,将cGMP-HRP Conjugate  ( 1000×)  稀释成1x工作浓度。  当日使用。

 

4.Anti-cGMP Monoclonal Antibody工作液

 

     实验前计算当次实验所需用量  (以50ul/孔计算)  ，实际配置时应多配置100-200ul.使用前15 分钟 ，用配好的1x Assay Buffer,将Anti-cGMP Monoclonal Antibody( 1000×)  稀释成1x工作浓度。  当日使用。

 

 

| 实验步骤

 

    使用前将各种试剂取出放置30分钟 ，平衡至室温。所有标准品和样品必需设置平行对照实验。 快速加入试剂至样品中 ，立即漩涡震荡2秒混匀。

1.依据实验键盘纸决定酶标条的使用量 ，将剩余的酶标条连同干燥剂一起放回密封塑料袋 ，密封， 4℃保存。

2. 移取50μ L中和液至各个微孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔和Blank(空白)孔。

3. 移取100μ L 0.1M HCl至NSB  ( Non-Specific Binding)  孔和 B0孔(0 pmol/mL cGMP标准品)。

4. 移取100μ L cGMP标准品至相应的孔。

5. 移取100μ L样品至相应的孔。

6. 移取50μ L 1×Assay Buffer 至 NSB  ( Non-Specific Binding)  孔。

7.移取50μ L 偶联酶至各孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔和Blank(空白)孔。

8. 移取50μ L 抗体工作液至各孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔、  Blank(空白)孔和NSB  ( Non-Spe cific Binding)  孔。

9. 将酶标孔置于孔板振动器上 ，250~500rpm ，室温孵育1小时。           

10. 在吸水纸上拍干微孔内溶液 ，加1x Assay Buffer 250μ L每孔洗3次 ，每次需拍干。

11. 最后一次洗涤 ，清空各微孔 ，在干净的无尘吸水纸上轻巧酶标板数次 ，以确保没有洗涤液残留。

12. 加5μ L 偶联酶至TA  (Total Activity)  孔。

13.每孔200μ L显色底物溶液 ，于室温静置5~15分钟 (显色底物A和B需在临用前15分钟内等体积 混合,并避光放置。  )

14. 每孔加入50μ L终止液。终止后立即读数。

15.清除酶标仪Blank(空白)孔值 ，读取450nm处的光密度值 ，在570nm至590nm之间最好有修正。 如果酶标仪不能自动清除Blank(空白)孔值 ，那么手动扣除每个读数的Blank(空白)孔光密度值。

 

|  操作流程图

 

                  

                                    

 

          

 

 

| 结果判断

   

1. ELISA的样本通常要设置1~2个复孔进行检测，分别求出标准品、实验组样本的吸光度的平均值。单个样本的检测值不应超出平均值的20%

2. 用软件ELISA Calc 的logistic 曲线拟合2（四参数）建立标准曲线（X轴上为标准品浓度，Y轴为对应的OD值）
3. 若样品OD值低于标准曲线下限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

 

| 典型数据

 

   由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。

   以下数据和曲线仅供参考，实验者需要根据自己的实验建立标准曲线。

         

                   

 

| 线性关系

 

cGMP浓度为16.0 pmol/mL的样品 ，用0.1M HCl进行连续七次1:2梯度稀释。将实际的cGMP浓度和 测定的cGMP浓度绘制图表。该直线的斜率为1.000 ，相关系数为0.999。

 

| 交叉反应

 

部分相关化合物的交叉反应由竞争ELISA测定。将可能的交叉反应物溶解到试剂盒分析缓冲液中 ，浓度从500pmol/mL至500,000pmol/mL。这些样品通过乙酰化在cGMP竞争分析中被测定 ，通过比  较样品中交叉试剂的实际浓度 ，可以计算出交叉反应 ,并用百分比(%)表示。